泛癌分析这么做可发14+文章，快来看看吧~

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泛癌分析这么做可发14+文章，快来看看吧~ by 作图丫

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导语：肿瘤是高度异质性的实体，由恶性细胞和各种组织浸润性基质细胞和免疫细胞组成，这些细胞构成了肿瘤微环境 (TME)1。单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 技术的出现提供了无偏倚和系统的分子分析，可以高分辨率表征 TME 中广泛的异质性。

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背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者定义了构成肿瘤-正常生态系统的无数细胞状态，并确定了不同细胞类型和器官的标志性基因特征。文章发表在《nature communications》上，文章题目为：Systematic dissection of tumor-normal single-cell ecosystems across a thousand tumors of 30 cancer types。

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数据介绍

为了全面研究肿瘤-正常生态系统，本研究对来自1070个肿瘤和493个正常样本的490万个单细胞转录组进行了综合分析，并结合泛癌137个空间转录组，8887个TCGA和1261个检查点抑制剂治疗的肿瘤。

结果解析

01

构建泛癌肿瘤-正常单细胞元图谱

为了对肿瘤和正常生态系统进行全面普查，本研究选择了已发表的未针对特定细胞类型进行富集的癌症、邻近正常和健康正常样本的 scRNA-seq 数据集。结果，构建了一个涵盖 104 个数据集中 30 种不同癌症类型的肿瘤-正常单细胞转录组图谱。经过数据整理，该元图谱涵盖了来自 1,070 个肿瘤的 490 万个细胞和来自 999 名捐赠者的 493 个正常样本（图 1A）。乳腺癌 (BRCA) 是最丰富的癌症类型，其次是 LC、头颈癌 (HNSC) 和肝细胞癌 (HCC)。为了分析不同癌症和组织类型的各种生态系统，整合并在全球范围内注释了整个收集的单细胞数据集。然后，应用 AND 门控算法来表征细胞类型特异性且普遍存在于各种器官的肿瘤和正常组织中的差异表达基因。随后，将注释的基因表达矩阵分成主要细胞类型，并使用 NMF 分析 3,8 分解为各种细胞状态（图 1B-D ）。

图 1

为了最大限度地恢复稀有细胞状态，通过扫描多个参数收集每个单个样本的 NMF 模块，并将得到的模块聚类并投影到均匀流形近似投影 (UMAP) 以搜索重复的共识模块。在 NMF 模块（细胞状态）簇中，本研究确定了代表来自环境 RNA 或双联体的污染的簇，并使用自动化流程将这些簇从进一步分析中移除（图 1E）。富含核糖体/线粒体基因的 NMF 模块簇也被过滤掉。NMF 模块的最终 UMAP 表示展示了多个样本中重复细胞状态的整体结构（图 1E）。利用 NMF 模块的 UMAP 表示，本研究可以根据每个细胞状态的来源（例如组织类型、器官等）直观地检查每个细胞状态的特征。根据平均 NMF 权重最高的基因定义和注释细胞状态。这使本研究能够使用以单细胞分辨率得出的细胞状态过滤器剖析肿瘤单细胞和批量转录组数据（图 1E），并监测它们在正常和肿瘤样本中的共现，以确定细胞类型之间的潜在相互作用及其对 TME 的贡献（图 1E）。本研究还应用细胞状态特征来反卷积批量 RNA-seq 队列（TCGA，免疫检查点疗法），以检查它们的临床意义（图 1E，生存分析）。最后，本研究使用细胞状态作为参考成分来投影细胞，以评估细胞状态和细胞类型15之间的对应关系（图 1E，细胞投影到参考成分），并使用细胞类型对 11 种癌症类型（n = 137）进行解卷积空间转录组学（图 1E）。

02

肿瘤正常生态系统通用标志基因的鉴定

实施了 AND 门控算法来系统地表征与正常组织相比在肿瘤中反复上调的标志基因，反之亦然，在构成不同器官 TME 的主要细胞类型中也是如此。对于 CD8+ T 细胞，共刺激分子 (CD27) 和免疫检查点或耗竭标志物（例如 CXCL13、PDCD1、TIGIT、CTLA4、LAG3 和 TNFRSF9）在肿瘤中普遍升高，而 IL7R、PTGER2 和 PTGER4 在正常组织中升高（图 2A、B）。值得注意的是，胰腺肿瘤组织的 CD8+ T 细胞没有显示 PDCD1 和 LAG3 的上调，这可能解释了免疫检查点抑制剂目前不适用于胰腺癌（PAAD），而其他癌症类型则不适用16。类似地，肿瘤相关 NK 细胞被 ZNF683 和 KRT81 标记。肿瘤中的 Treg 上调了具有调节功能的基因，例如 RBPJ、CXCR3 和 ZBED2，而正常组织中的 Treg 上调了 CCR7 和 CXCR5，表明免疫细胞募集和浸润的机制不同17（图 2A、B）。

图 2

特别是，肿瘤浸润的巨噬细胞普遍表达免疫检查点 (IL4I1) M2 极化相关 (SPP1)和炎症基因 (CCL7、ADAMDEC1 和 SLAMF9)，而肿瘤中的树突状细胞表现出 CCL19 和 LAMP3 表达升高，这与炎症和迁移功能有关（图 2A、B）。基因本体论 (GO) 分析表明，肿瘤浸润巨噬细胞、树突状细胞和 CD8+ T 细胞中上调的基因在相关功能和通路中富集，包括对病毒的防御反应、对 II 型干扰素的反应、炎症反应、淋巴细胞的趋化性和细胞因子介导的信号通路 (图 2C)。 对于非免疫细胞类型，癌细胞普遍表现出蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性 (PRKCA、GSK3B 和 CAMKK2)、糖酵解 (PLOD1、EGLN3 和 P4HA1)、mTORC1 信号传导 (SLC2A1、GMPS 和 PDK1) 以及与细胞周期过程的正向调节相关的 GO 术语 (E2F7、E2F8 和 KIF23；图 2C)。癌症相关成纤维细胞 (CAF) 在各种器官中表达众所周知的标志物，包括 FAP、COL1A1、COL10A1、MMP11 和 CTHRC120,21，以及其他基因，例如 INHBA、SLC12A8、F2R 和 COL12A1（图 2A、B）。肿瘤内皮细胞上调血管生成相关基因，包括 CHST1、FOLH1 和 MMP1522–24。肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞在细胞外基质组织、细胞迁移调节、细胞基质粘附和细丝蛋白结合方面均富集（图 2C）。总体而言，这些结果概述了 TME 成分失调的标志性特征。

03

将肿瘤-正常生态系统反卷积为异质细胞状态

对复杂的肿瘤和正常生态系统的系统剖析确定了无数细胞状态或共同调节基因，这些基因与之前报告的特征以及之前泛癌分析中尚未确定的特征高度一致（图 3A ）。对于髓系细胞状态，本研究注意到 CTSK+ 巨噬细胞（SLC9B2 和 CTSK）、CXCL9+ 巨噬细胞（CXCL9 和 ENPP2）、朗格汉斯细胞（CD1A 和 CD207）、单核吞噬细胞（DLEU2 和 FMN1）以及以趋化因子（CXCL1 和 CXCL5）、迁移（SLAMF1）和免疫调节标志物（ITGB8）为标志的 PRR 诱导活化状态。SLAMF1 和 ITGB8 在 TLR 诱导的 DC 成熟过程中上调，因此称为 PRR 诱导活化。本研究还确定了各种 B 细胞状态，包括生发中心 B 细胞 (GCB；SUGCT 和 RGS13) 和浆细胞前体 (FNDC3B 和 FNDC3A) 状态 (补充图 S3F)。使用 Ro/e 分析评估免疫细胞状态的组织富集情况，发现肿瘤中存在耗竭的 CD8+ T 细胞 (LAG3 和 TOX)、SPP1+ (SPP1 和 ANGPTL4)、CTSK+ 和 CXCL9+ 巨噬细胞状态 。GCB 和浆细胞状态在邻近正常组织中丰富，而 PRR 诱导的活化状态在健康正常组织中富集。利用细胞类型特异性细胞状态谱作为嵌入的参考，本研究确定了能够很好地反映相应细胞状态的细胞类型（图 3B）：PRR 诱导的激活状态被捕获为 PRR 诱导的 mo-DC 细胞簇，主要来源于妇科癌症，如卵巢癌 (OV) 和子宫体子宫内膜癌 (UCEC) 患者，与 PRR 诱导的激活状态评分的分布一致。上皮细胞和神经细胞被分解为 35 种状态，随后使用这些细胞状态的参考成分分析按其来源对细胞进行聚类。发现了上皮标志性程序，如循环（TOP2A 和 BIRC5）和应激（PPP1R15A 和 KLF5）。

图 3

对于先前分类的特征，肾细胞癌 (RCC) 和胶质母细胞瘤表现出高水平的缺氧和金属反应，而低级别胶质瘤、UCEC 和神经母细胞瘤分别表现出低水平的部分上皮-间质转化 (pEMT)、氧化磷酸化和抗原呈递机制特征。值得注意的是，本研究对间充质来源的不同细胞状态进行了分类和注释，包括 CCL19+ 成纤维细胞 (CCL19 和 CXCL13)、PI16+ 成纤维细胞 (MFAP5 和 IGFBP6)、肌成纤维细胞 (ACTA2 和 MYH11)、促纤维增生性成纤维细胞 (LRRC15 和 MMP11) 以及特定器官独有的成纤维细胞状态，可能反映器官特异性功能 (图 3C、D )。当投射到参考成分上时，这些状态也被识别为各种间充质亚群。虽然纤维增生性成纤维细胞状态具有高度的肿瘤特异性，但肌成纤维细胞群体均匀分布在非恶性组织中，这与之前的报告表明肌成纤维细胞是主要的 CAF（图 3E） 形成鲜明对比。这些不同的细胞状态共同塑造了复杂的肿瘤生态系统（图 3F）。例如，在肿瘤中，上皮细胞的 T 细胞排斥程序与 Treg 状态密切相关，促进免疫逃逸和肿瘤进展。基底鳞状细胞状态与炎症状态（例如 CXCL9+ 巨噬细胞、LAMP3+ DC 和间充质源干扰素状态）仅在肿瘤组织中同时发生，表明基底鳞状细胞起源的癌症类型（HNSC 和皮肤鳞状细胞癌）的内在特征会触发免疫细胞浸润（图 3F）。特别是，发现了间充质源干扰素状态与其他细胞类型和 LAMP3+ DC 的干扰素状态的多重巧合（图 3F）。其与 LAMP3+ DC 的肿瘤特异性巧合表明间充质源干扰素是启动肿瘤干扰素信号传导所必需的，以便随后募集免疫细胞和 T 细胞启动。

04

AKR1C1+和WNT5A+炎症成纤维细胞的不同亚型特征

当本研究将间充质细胞集合投射到定义的状态时，发现了多种显示免疫相关基因表达的成纤维细胞亚型（图 4A）。其中，本研究注意到 AKR1C1+ 和 WNT5A+ 表达炎症成纤维细胞之间的区别，它们都与 PRR 诱导的激活状态相吻合并具有相似的细胞因子基因表达（CXCL1/3/8；图 4A ）。然而，它们在标记基因（AKR1C1、FOSL1、LIF 和 THAP2 vs. WNT5A、GREM1、TNC 和 MMP1）、组织来源（正常 vs. 肿瘤）和器官偏好方面存在显著差异（图 3E、4A、B ）。为了研究这两种状态是否代表真正不同的成纤维细胞亚型，本研究对涵盖乳腺、结肠、头颈部和卵巢的肿瘤和正常组织的 scRNA-seq 数据集进行了详细检查。除乳腺组织外，肿瘤组织表达的趋化因子基因（CXCL1/3/8）比正常组织多。同时，这两种类型的炎症成纤维细胞中 AKR1C1 和 WNT5A 的表达模式在不同器官中是不同的（图 4C）。BRCA 和 OV 患者均表达 AKR1C1 和 WNT5A，而正常乳腺组织仅表达 AKR1C1。有趣的是，结直肠癌 (CRC) 和 HNSC 患者表达 WNT5A 但不表达 AKR1C1，而相应的正常组织则表现出相反的表达模式（图 4C）。

为了深入了解这些炎性成纤维细胞如何塑造 TME，本研究进行了配体-受体分析，以揭示 BRCA、CRC、HNSC 和 OV 样本中 AKR1C1+ 和 WNT5A+ 炎性成纤维细胞与其他细胞类型的不同相互作用（图 4D ）。在这两种炎性成纤维细胞之间发现了离散的相互作用模式。AKR1C1+ 炎性成纤维细胞与 CTSK+ 巨噬细胞 (CD44:SIGLEC15) 相互作用，已知后者可在多种癌症类型中诱导癌症进展和转移 (图 4D )。此外，AKR1C1+ 炎性成纤维细胞强烈表达 IL6，IL6 与 DC1 和 PRR 诱导的 mo-DC 上表达的 IL6R 相互作用，可能促进肿瘤生长和治疗耐药性。本研究还发现了 TNFRSF12A (AKR1C1+ 炎性成纤维细胞) 和 TNFSF12 (ILC3) 之间的相互关系。相反，WNT5A+ 炎性成纤维细胞通过 IL24:IL20RA 和 WNT5A:FZD5 通路与癌细胞相互作用，这可能促进癌症进展和化学耐药性 (图 4D)。此外，WNT5A+ 炎性成纤维细胞与成纤维细胞群（包括促纤维增生性成纤维细胞 (WNT5A:PTK7、WNT5A:ROR2 和 GREM1:ACVR1)）表现出强烈的相互作用，与自身具有同型相互作用 (WNT5A:PTK7 和 GREM1:ACVR1)，以及 BMP4+ 成纤维细胞 (GREM1:ACVR1)，以模拟伤口修复过程，通过自分泌和旁分泌机制增强细胞的间充质增殖和迁移表型(图 4D )。还发现了 WNT5A+ 炎性成纤维细胞的 GREM1 和内皮细胞的 ACVRL1 的促血管生成和促炎性参与。总的来说，WNT5A+ 炎性成纤维细胞分泌多种配体，如 WNT5A、GREM1 和 IL24，这些配体可在多种情况下增强增殖、迁移和存活，包括组织再生、炎症和癌症。它们与癌细胞、成纤维细胞和内皮细胞等多种细胞成分相互作用，最终形成促肿瘤发生和核心炎症 TME。为了定位和验证 WNT5A+ 炎性成纤维细胞群，本研究在 CRC 和 HNSC 组织样本中针对 WNT5A、GREM1 和 PDGFRA 进行了 RNA 单分子荧光原位杂交 (smFISH)。通过来自癌症组织的促纤维化基质中的 WNT5A、GREM1 和 PDGFRA RNA 探针的重叠信号证实了 WNT5A+ 炎性成纤维细胞的存在（图 4E ）。

图 4

本研究假设不同的微环境会诱发这两种炎性成纤维细胞的不同表型。为了检查它们的共定位模式，本研究分析了空间转录组学（AKR1C1+ 炎性成纤维细胞的 BRCA、OV 和 UCEC，WNT5A+ 炎性成纤维细胞的 CRC 和 HNSC）。AKR1C1+ 炎性成纤维细胞与癌细胞、中性粒细胞、CTSK+ 巨噬细胞、DC1 和 PRR 诱导的 mo-DC 明显共定位（图 4F、G）。相反，WNT5A+ 炎性成纤维细胞与纤维增生性成纤维细胞、耗竭的 CD8+ T 细胞、Treg、DC1 和 PRR 诱导的 mo-DC 明显共定位，突出了其在塑造免疫抑制性 TME 中的作用（图 4F、G）。特别是，AKR1C1+ 和 WNT5A+ 炎性成纤维细胞分别与纤维增生性成纤维细胞和中性粒细胞互斥，进一步突出了两种炎性成纤维细胞之间的区别（图 4F、G ）。WNT5A+ 炎性成纤维细胞与耗竭的 CD8+ T 细胞和 Treg 的细胞相互作用和空间接近性促使研究其与治疗前/治疗后 HNSC 样本中的免疫疗法治疗的关联。与其他间充质细胞群不同，免疫疗法治疗后 WNT5A+ 炎性成纤维细胞和促纤维增生性成纤维细胞呈增加趋势。这表明 WNT5A+ 炎性成纤维细胞在免疫疗法治疗过程中可能会受到影响。总的来说，尽管这两种炎性成纤维细胞共同表达 CXCL1/3/8，但不同的器官/组织偏好、细胞相互作用模式和与其他细胞类型的空间接近性表明它们在形成免疫逃避和促肿瘤发生性 TME 方面发挥着不同的作用。

05

确定不同癌症类型的免疫治疗预测细胞状态

为了描绘跨组织来源的多细胞生态系统，本研究构建了一个细胞状态共现的无向网络，并确定了肿瘤、邻近正常组织和正常组织内的不同网络群落（图 5A-C）。值得注意的是，一个肿瘤生态系统明显被肿瘤内各种细胞类型的干扰素状态所占据（图 5A）。该群落还包含众所周知的 TLS 组成部分（LAMP3+ DC、CCL19+ 成纤维细胞和 Tfh）、特定的 DC 和巨噬细胞（DC1、pDC 和 CXCL9+ 巨噬细胞）以及抗原呈递机制状态。相比之下，干扰素富集群落中包含的几种免疫细胞状态分散在整个健康正常网络中（图 5B）。有趣的是，在相邻正常网络中发现了 LAMP3+ DC 与干扰素富集群落中包含的其他免疫细胞状态（DC1、pDC、朗格汉斯细胞和 Tfh）的邻近区域（图 5C），这意味着与健康正常组织相比，相邻正常组织中甚至存在不同的细胞生态系统配置。本研究还发现了另一个肿瘤特异性群落，其中有促肿瘤发生状态，例如 pEMT、上皮 T 细胞排斥程序、SPP1+ 巨噬细胞和促纤维增生性成纤维细胞（图 5A）。促肿瘤发生群落中还发现了肿瘤富集巨噬细胞（CTSK+ 和 C1QC+ 巨噬细胞）和 WNT5A+ 炎性成纤维细胞状态，它们有助于肿瘤发生的不同方面。

图 5

在确定了肿瘤、邻近正常组织和健康正常组织中干扰素富集和促肿瘤发生群落的多样性和动态后，本研究利用这些细胞状态对膀胱癌 (BLCA)、黑色素瘤 (MEL)、RCC 和本研究的 LC 队列中检查点抑制剂治疗样本的大量转录组进行反卷积 (图 5D)。在泛癌症荟萃分析中，耗竭的 CD8+ T 细胞、间充质来源的干扰素、CXCL9+ 巨噬细胞、CD160+ 上皮内淋巴细胞、Treg、DC1、ISG15+ 巨噬细胞、XCL1+ /CD16+ NK 细胞、IFIT1+ 干扰素信号传导、Tfh、GCB、LAMP3+ DC、pDC、CD16+ 单核细胞来源的巨噬细胞、CCL19+ 成纤维细胞和浆细胞前体状态凸显了检查点阻断的临床益处 (图 5E)。同时，先前定义的基因特征（例如来自各种研究的 PD-L1 通路、抗原呈递机制和干扰素特征）赋予了对免疫疗法的良好反应。具有显著预测能力的细胞状态大多是干扰素富集群落的组成部分。在有利于免疫治疗的细胞状态中，本研究使用 RNA smFISH 证实了 HNSC 组织样本中存在表达干扰素的间充质细胞（CXCL10 和 PDGFRA）。相反，在所有队列中，促纤维增生成纤维细胞、成骨细胞、间皮衍生成纤维细胞和 CTSK+ 巨噬细胞细胞状态与对免疫疗法的不良反应相关，其中许多属于促肿瘤群落（图 5E）。

06

利用空间转录组学对多种癌症类型的肿瘤生态系统进行研究

为了研究肿瘤生态系统的空间组织，本研究对 11 种不同癌症类型（n = 137，图 6A）的空间转录组数据进行了系统分析。鉴于 TLS 之前与有利的免疫疗法反应有关，本研究首先旨在得出特定于 TLS 的基因特征，并研究与对免疫疗法的良好反应和病理定义的 TLS 相关的成分之间的空间关系。为了实现这一目标，本研究利用了包含病理定义的 TLS 斑点50 的 RCC 空间转录组数据。通过对 TLS 和非 TLS 斑点进行差异表达分析，本研究获得了有效区分 TLS 和非 TLS 斑点的 TLS 特征（图 6B ）。本研究的 TLS 特征还预测了免疫治疗组对免疫疗法的良好反应（图 6C）。此外，本研究利用 cell2location 将每个空间点与单细胞转录组谱进行反卷积，并比较 TLS 和非 TLS 点之间的细胞类型丰度。本研究确定了在 TLS 中显著富集的细胞类型，包括 Treg、浆细胞、CD16+ / XCL1+ NK 细胞、Tfh、LAMP3+ DC、CCL19+ 成纤维细胞和 ILC3（图 6D）。值得注意的是，某些细胞类型，如耗竭的 CD8+ T 细胞、ISG15+ 巨噬细胞、DC1 和 pDC，与 TLS 缺乏空间关联，但它们对免疫疗法表现出与 TLS 富集细胞类型相似的良好反应（图 5E、6D）。通过评估其他癌症类型中 TLS 富集细胞类型的空间共定位模式，本研究证实了 TLS 富集细胞类型（包括 LAMP3+ DC、Treg、浆细胞和 CCL19+ 成纤维细胞）在多种癌症类型中的共定位（图 6E）。此外，本研究观察到 TLS 特征有效地捕获了不同癌症类型的各种肿瘤样本中富含 TLS 富集细胞类型的斑点（图 6E）。相反，促肿瘤发生成分表现出不同的共定位模式。值得注意的是，促纤维增生成纤维细胞和 SPP1+ 巨噬细胞都与 WNT5A+ 炎性成纤维细胞共定位，但彼此相互排斥，表明对促肿瘤发生环境有独立的贡献。总之，本研究利用泛癌症单细胞转录组和空间转录组来表征 TME 复杂的空间组织。

图 6

小编总结

本研究的图谱根据细胞相互作用和空间共定位模式描述了 AKR1C1 或 WNT5A 标记的炎性成纤维细胞之间的区别。共现分析揭示了干扰素富集的群落状态，包括三级淋巴结构 (TLS) 成分，它们在肿瘤、邻近正常和健康正常组织之间表现出差异性重新布线。使用免疫疗法治疗的癌症（n = 1261）验证了干扰素富集群落状态对免疫疗法的良好反应，包括本研究的肺癌队列（n = 497）。空间转录组的反卷积区分了免疫疗法有利成分中 TLS 富集和非富集细胞类型。本研究对肿瘤正常生态系统的系统剖析提供了对肿瘤间和肿瘤内异质性的更深入理解。

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